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线上融资炒股 同腾睿杰I.DOT 赋能叶酸与 DTG 致畸关联研究，精准检测破解临床谜题_缺陷_ng_畸形
2016年，世界卫生组织（WHO）将多替拉韦（DTG）列为HIV感染一线治疗药物，其高效的病毒抑制能力与良好的安全性迅速使其成为全球首选方案。然而，2018年博茨瓦纳Tsepamo研究打破了这一乐观局面——孕期暴露于DTG的女性线上融资炒股，胎儿神经管缺陷（NTD）风险较非DTG治疗组升高9倍（0.94%vs.0.12%）[1]，这一发现引发全球对DTG妊娠期安全性的高度关注。
NTD是全球最常见的出生缺陷之一，其发生与胚胎神经管闭合异常密切相关，而叶酸缺乏是明确的风险修饰因子——孕前3个月至孕期补充400 μg/天叶酸可降低50%-75%的NTD发生率[2,3]。值得注意的是，博茨瓦纳等未强制实施叶酸强化食品政策的地区，人群叶酸缺乏率超过20%，而DTG被证实可非竞争性拮抗叶酸受体1（FOLR1），在临床治疗浓度（3-10 μM）下降低叶酸与受体结合效率达46%。这提示DTG的致畸性可能与叶酸水平存在交互作用，但传统检测技术因无法精准量化低叶酸状态下的代谢波动，导致“药物-营养”协同效应的机制研究停滞不前。
实验方法
动物模型与分组设计
实验对象
展开剩余90%实验对象为CD-1 品系孕鼠（Charles River Laboratories），适应性喂养 4 周后分为两组饮食：正常叶酸组（NF）：3mg/kg 叶酸饮食（模拟人类推荐摄入量[3]）；低叶酸组（LF）：0.3mg/kg 叶酸饮食（模拟叶酸缺乏环境，叶酸含量仅为正常组 10%）。
DTG暴露
胚胎期E6.5-E12.5（神经管闭合关键期），通过饮水给予DTG：
对照组（0X）：饮用纯水；
治疗剂量组（1X）：3.5mg/L（人类等效剂量[4]）；
超治疗剂量组（5X/10X）：17.5mg/L、35mg/L，模拟临床过量暴露场景；
样本量：每组20-24只孕鼠，足月（E18.5）剖宫取胎，共检测1200+胎儿。
I.DOT 核心技术：血清叶酸定量分析
基于叶酸结合蛋白（FBP）的竞争结合法，利用Dispendix I.DOT 非接触式液体处理器构建高灵敏度检测体系[5]：
1. 探针阵列打印：在96孔板底部以2×2阵列形式打印50ng/mLFBP（Sigma-AldrichF0504），单孔反应体积仅40μL（传统方法需200μL），试剂消耗降低80%；
2. 标准曲线构建：配置0.09375-6ng/mL叶酸标准品，结合叶酸-辣根过氧化物酶共轭探针（FA-HRP），通过化学发光底物（ThermoScientificSuperSignal）实现纳克级精准定量，检测下限达0.05ng/mL；
3. 数据优势：非接触式分配避免交叉污染（污染率<0.01%），变异系数（CV）仅3.2%，较手动移液（CV>15%）精度提升4倍，成功捕捉低叶酸组血清叶酸浓度波动[6]。
发育缺陷评估
1.大体观察：记录胚胎着床数、活胎数、死胎数，计算植入后丢失率；
2.组织学分析：采用Wilson技术解剖软组织结构，检测神经管缺陷（露脑畸形）、腭裂；
3.骨骼染色：阿尔新蓝-茜素红双染法观察颈椎/胸椎融合、肋骨畸形等骨骼异常[7]。
实验关键结果
神经管缺陷（NTD）：低叶酸激活DTG毒性
低叶酸+DTG组：3窝共4例胎儿出现露脑畸形（图1A），发生率0.415%，显著高于历史对照（0.01%），Fisher精确检验p=0.0007（表2）；
正常叶酸组：无论DTG剂量（1X/5X/10X），均未观察到NTD，证实充足叶酸可完全屏蔽DTG的致畸风险（表1）。I.DOT关键数据：低叶酸组血清叶酸均值5.73±0.97ng/mL，虽未达贫血阈值，但变异显著升高（p=0.0483），提示个体间叶酸利用差异放大DTG风险（表1）。
图1. 观察大体和内部表型的形态学。具有A）露脑神经管缺陷、B）正常头部形态、C）腭裂和D）正常腭形态的CD 1 E18.5小鼠的代表性图像。
表1. 具有平均值和标准差的妊娠结局的总结
多重发育缺陷：叶酸不足协同 DTG 毒性
腭裂：正常/低叶酸组共3窝出现腭裂（图2C），与DTG暴露显著相关（p=0.0167），提示DTG对颅神经嵴细胞迁移的干扰不依赖叶酸水平（表2）；
骨骼异常：低叶酸+10XDTG组肋骨畸形率达13%（3窝17例），主要表现为肋骨融合/多余肋骨，而正常叶酸组仅2%（2窝4例），I.DOT检测显示高剂量DTG下叶酸受体抑制率从30%升至55%（表3）。
表2. 大体和软组织畸形总结
表3. 骨骼畸形和变异总结
母鼠安全性
各组母鼠体重增长、血常规、肝肾功能均无显著差异，证实 DTG 毒性主要靶向胚胎发育，而非母体健康（图2，表1）
图2.整个妊娠期间母体平均体重增加。正常喂养的母鼠（3.0毫克/千克，实线）和低（0.3mg/kg，虚线）叶酸饮食用0X（正常饮食n=21，低饮食n=24，蓝色），1XHED（3.5毫克/升）（正常饲料n=23，低水平饲料n=20，绿色），5XHED（17.5mg/L）（正常饮食n=20，低饮食n=20，黄色）或10XHED（35mg/L）（正常饮食n=21，低饮食n=20，橙色）DTG从E6.5至E12.5。每隔一天对母鼠称重。条表示标准偏差。
总结与讨论
本研究通过I.DOT检测发现，低叶酸环境中DTG使胚胎叶酸摄取效率下降46%，导致神经管闭合关键基因如Pax3、Shh表达异常，最终引发露脑畸形。正常叶酸组血清叶酸均值6.89±2.28ng/mL，足以补偿DTG的受体拮抗作用，而低叶酸组波动幅度达2.6ng/mL，为正常组1.3倍，使部分胚胎落入“叶酸匮乏阈值”，激活致畸通路。
临床对照上，博茨瓦纳未实施叶酸强化，2018年DTG相关NTD风险0.94%，随着叶酸补充推荐，2022年风险降至0.19%，与实验中“低叶酸组风险随叶酸水平升高而下降”一致 [8,9]；叶酸强化国家如美国，人群血清叶酸均值提升35%，使用DTG时NTD发生率仍维持0.09%基线水平，验证“叶酸充足可阻断DTG致畸”。技术价值上，I.DOT仅需5μL临床样本即可检测，解决传统方法样本耗竭问题，且凭借高通量（100+样本/天）与低CV（<5%），成功捕捉低叶酸组0.415%的NTD发生率，为罕见致畸事件研究提供可靠工具。
在技术价值层面，I.DOT技术凭借微量样本精准检测能力（仅需5μL血清即可完成检测），有效解决了传统方法中珍贵临床样本耗竭的难题，尤其适用于孕妇血清等稀缺样本的叶酸代谢分析；其高通量（100+样本/天）与低变异系数（CV<5%）特性，成功捕捉到低叶酸组0.415%的罕见神经管缺陷（NTD）发生率——这一精度远超传统方法（易因误差漏检），为发育毒理学研究中低概率致畸事件的量化分析提供了可靠工具。
参考文献
1. Zash R, Makhema J, Shapiro RL. Neural-Tube Defects with Dolutegravir Treatment from the Time of Conception. N Engl J Med 2018; 379(10):979–981.
2. Blom HJ, Shaw GM, den Heijer M, Finnell RH. Neural tube defects and folate: case far from closed. Nat Rev Neurosci 2006; 7(9):724–731.
3. CDC. Recommendations for the use of folic acid to reduce the number of cases of spina bifida and other neural tube defects. MMWR Recomm Rep 1992; 41(RR-14):1–7.
4. Eadon MT, Zhang H, Skaar TC, Hato T, Dagher PC, Gupta SK, et al. A two-week regimen of high-dose integrase inhibitors does not cause nephrotoxicity in mice. Antivir Chem Chemother 2015; 24(2):72–76.
5. Cabrera RM, Shaw GM, Ballard JL, Carmichael SL, Yang W, Lammer EJ, et al. Autoantibodies to folate receptor during pregnancy and neural tube defect risk. J Reprod Immunol 2008; 79(1):85–92.
6. Cabrera RM, Souder JP, Steele JW, Yeo L, Tukeman G, Gorelick DA, et al. The antagonism of folate receptor by dolutegravir: developmental toxicity reduction by supplemental folic acid. AIDS 2019; 33(13):1967–1976.
7. Massa V, Cabrera RM, Menegola E, Giavini E, Finnell RH. Valproic acid-induced skeletal malformations: associated gene expression cascades. Pharmacogenet Genomics 2005; 15(11):787–800.
8. Zash R, Holmes L线上融资炒股, Diseko M, Jacobson DL, Brummel S, Mayondi G, et al. Neural-Tube Defects and Antiretroviral Treatment Regimens in Botswana. N Engl J Med 2019; 381(9):827–840
9. Zash R, Holmes L, Diseko M, Jacobson D, Mayondi G, J M, et al. Update on neural tube defects with antiretroviral exposure in the Tsepamo Study, Botswana. In: AIDS. Montreal; 2022.
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